上海交通大学的一次研学

摘要

关键词：幽门螺旋杆菌、qPCR、基因检测、生物芯片、微流控芯片

首先通过查询研究背景，可知，它对人类的影响很大（致癌风险高、感染率较高），需要检测。现有的最好的检测方法是碳13 14，但依然存在一定的缺点，而基因检测涵盖两者优点，所以基因检测必要性强。之后，了解PCR扩增技术，做qPCR试验和RPA实验，得出结果（其中qPCR试验结果正常，RPA实验结果为阴性），进行分析。之后，明确未来研究方向为基因检测、技术提升，成本降低、流程优化。最后，得出结论：本研究针对幽门螺旋杆菌基因检测的现有方法的局限性提出了一种基于液滴回收滑动式的微流控芯片对靶向目标序列的检测平台，并结合qPCR、RPA两种实验进行了初步的验证。

目录

第一章研究背景

首先我们上网查找了幽门螺旋杆菌的定义与特性。幽门螺杆菌是一种革兰氏阴性、微需氧、螺旋状的细菌。其主要特性包括可在胃酸环境中生存、螺旋形状有助于穿透胃粘膜轻微的慢性发炎、可导致胃及十二指肠溃疡。而且，它的致癌风险较高，70%的胃癌都和幽门螺杆菌有关，其被世界卫生组织列为一类致癌物。

幽门螺杆菌不仅致癌风险高，它的感染率也很高，对人们有一定的危害性，这也正是我们做基因检测的主要原因。目前全球约43-44%的成年人感染（2015-2022），1980-1990年期间，感染率曾高达58%，儿童与青少年感染率相对稳定，约35%。 (Chen YC, 2024)以上是全球的情况，我们还搜索了中国感染情况。中国人个体感染率约在40%附近，家庭感染率高达70%，不同人群感染范围约为35.4%-66.4%，农村高于城市，成人高于儿童。 (央视网, 2023)幽门螺旋杆菌可能导致的健康问题包括慢性胃炎、消化性溃疡、胃癌、胃功能障碍。

如此可见，幽门螺旋杆菌对我们生活的影响很大，所以要进行检测。现有的检测方法包括细菌培养、组织学检查、胃镜（RUT）、血清抗体、粪便抗原（SAT）、碳13 14吹起，其中碳13 14吹起法是现有最好的检测方法，但是碳13具有灵敏度较低的缺点，碳14属于放射性同位素，稳定性和安全没有保障，而这就体现出了幽门螺杆基因检测的必要性，它包含了碳13稳定性高和碳14灵敏度高的优点。幽门螺旋杆菌基因检测的目的主要是为了明确感染，进而指导治疗，预防相关疾病的发生和发展。基因检测适应不同人群的需求，它的无创和安全，适合儿童、孕妇等特殊人群，弥补传统检测方式局限。它还可以预测抗生素耐药性，避免无效治疗。基因检测不受胃酸和药物干扰，准确识别幽门螺杆菌DNA，提升诊断准确性，这就是它的敏感性与特异性。它可以进行大规模筛查与研究，评估患者发展为胃癌等严重疾病的风险。

以上是我们的幽门螺杆菌基因检测的研究背景。

第二章研究方法

一、qPCR实验

为了检测幽门螺旋杆菌部分基因的表达水平，采用荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）技术进行分析。

1.引物序列：

16S rRNA基因（检测是否含有）：

正向引物：ATAAGCACCGGCTAACTCCG

反向引物：TTACGCCCAGTGATTCCGAG (NCBI, 2025)

cagA（检测是否为高危型）：

正向引物：TGAGCACTACGAATGGCGTT

反向引物：GGGGACAATCCTTTAGCCCA (NCBI, 2025)

2.PCR反应体系配置

将实验样本经过提纯等处理并将全部试剂离心约10s，向EP管中加入2×Taq 40μL、正向引物（10μmol/L）1.6μL、反向引物（10μmol/L）1.6μL、ddH₂O 20.8μL，并离心约10s。

将EP管中液体移至8联qPCR管中的3个管，每个管移入16μL液体，然后加入实验样本4μL。

同时向另外3个管中添加2×Taq 10μL、正向引物（10μmol/L）0.4μL、反向引物（10μmol/L）0.4μL、ddH₂O 9.2μL作对照。将整个qPCR管离心约10s。

3.PCR反应程序

预热95℃-5min，扩增40cycle（95℃-10s，58℃-30s），溶解曲线+1℃。

4.溶解曲线分析

先观察对照组曲线未见扩增，验证实验过程中无污染，实验结果可信。

对实验组的溶解曲线与标准荧光曲线进行分析。

二、RPA实验

为了更加高效的完成对16S rRNA与cagA基因的检测，我们设计了使用RPA+微流控技术的检测实验。实验采取迈恩生物的MARS检测仪。

1.RPA反应体系制备

将试管1与试管2离心约10s。

向试管1（保护剂）中加入拭子保存液200μL，试管2内溶液（裂解液）800μL，离心3min。

2.进行RPA实验

将试管1溶液转移至试剂盒加样孔1000μL，将试剂盒放入MARS检测仪，开始检测。

在MARS检测仪中，样本先经过膜结构，DNA、蛋白质等物质吸附在膜上，其他物质透过膜结构进入废液孔。紧接着，漂洗液经过膜结构洗去非DNA以外的物质。随后解离液流过膜，将DNA解离并带到反应腔室中，释放反应所需的酶、引物（与上文所做qPCR采用的引物相同）、蛋白、标记物等，进行RPA反应，约40cycle后得出结果

3.分析实验结果

在完成40cycle后，分析Rn值（表示荧光信号强度）曲线。若Rn值过高，则给出阳性参考，若Rn值未超过一定阈值，但是扩增曲线呈现出典型的“S”形增长模式，则也考虑给出阳性参考，需进行多次检测。反之则给出阴性参考。

第三章研究成果

一．qPCR实验结果

PCR实验扩增正常，产物溶解温度约为88℃

二、RPA实验结果

由于缺少实验条件，故采用猫传染病检测进行模拟。

所有结果均为阴性。

第四章讨论及展望

在此次研究中，我们对已有的技术进行了学习与研究，包括qPCR技术以及酶切、电泳技术和微流控芯片等等，也了解到一些目前的前沿科技比如数字PCR、微流控芯片更多的应用。

一、实验结果分析

1、qPCR实验

qPCR溶解曲线显示在约88℃处有一个明显的单一峰值。这表明PCR扩增产物的特异性良好，没有检测到非特异性扩增或引物二聚体的形成。目标基因的成功扩增。

扩增曲线呈现出典型的“S”形增长模式，包括基线期、指数增长期和平台期。这表明PCR反应效率高，DNA模板的扩增过程正常。曲线的斜率和达到平台期的循环数（Ct值）可以反映样本中目标基因的初始拷贝数。从图中看，扩增曲线平滑且上升趋势明显，进一步验证了qPCR实验的成功。

2、RPA实验

4项指标的Rn曲线均平缓，未到阳性阈值，没有检测到非特异性扩增或引物二聚体的形成，这表明该样本并未感染FHV、FCV、M、C任何一个细菌。

在这里引入一组显阳性的实验结果。

这里FHV的Rn值明显高于阈值，其Rn曲线呈现出典型的“S”型扩增曲线，说明该样本中存在FHV病毒的DNA，属于明确的阳性结果。其余三项指标（FCV、M、C）的扩增曲线仍接近基线，无有效信号，表明这些病原未在该样本中被检测到。

二、未来研究方向

1、基因检测

未来的研究将不再局限于幽门螺旋杆菌的少数几个关键基因，而是致力于开发综合检测方案，能够同时检测更多的相关基因。其中包括但不限于

耐药基因：针对幽门螺旋杆菌，筛查其对于常用抗生素的耐药基因。这将有利于指导临床医生选择更有效的个体化治疗方案，降低耐药性的发生与传播。
毒力基因：对幽门螺旋杆菌毒力因子基因的深入研究这些基因与胃炎、胃溃疡乃至胃癌的发生发展有着密切的关系。通过对这些基因的检测，可以更好地评估感染的致病风险高风险人群进行早期介入。
宿主遗传易感性基因：探索宿主基因型与幽门螺旋杆菌感染结局的关系，如与炎症反应、免疫应答有关的遗传基因。这将有助于识别更易感染幽门螺旋杆菌或更容易发展为严重疾病的个体。
高特异性与快速检测（集成CRISPR技术）：微流控平台与CRISPR-CAS基因编辑技术的结合，将实现对目标基因序列的超高特异性识别和快速检测。CRISPR-CAS系统能够提供近乎即时的结果，进一步缩短检测时间，提高诊断效率，尤其适用于POCT（即时检测）场景。

基因检测范围的扩大将提供更全面的信息，有助于实现更精确的诊断，更有效的治疗，以及更个性化的风险评估。

2、技术提升

未来的幽门螺旋杆菌基因检测将以微流控技术为核心，其显著优势是检测成本可以大幅降低，检测效率和准确性也会同步提高。这一转变将使基因检测的可及性和普惠性更强。

样本用量大幅减少：传统的检测方法通常需要ML级别的样本量，而微流控技术只需要ML级别NL级别的样本量就可以了。这大降低了样本采集和处理的费用，特别是儿童和老年患者，减轻了的不适感。
试剂消耗显著下降：微流控芯片内的反应体积可由传统的数十微升下降到纳升水平，这意味着PCR试剂、酶、引物等昂贵耗材的消耗将减少90%以上。单次检测试剂成本将从目前的几百元降至一百元左右，甚至更低。
设备的小型化和便携化：微流控技术可以在一块微型芯片上集成样品前处理、核酸扩增和信号检测等多个步骤，从而避免了对昂贵的设备的依赖。今后的检测设备将更加小型化、便携化，甚至可以手持，设备采购成本维护成本都将降低。

3、成本降低

为实现幽门螺旋杆菌基因检测的低成本化，我们将从以下几个方面着手优化：

材料选择：优先选用低成本、易于加工的聚合物材料（如PDMS、PMMA）替代传统的硅基或玻璃基材料。
制备工艺：开发并推广适合大规模、自动化生产的微流控芯片制备工艺，如注塑成型、热压成型或3D打印技术，以降低单片芯片的生产成本。

4、流程优化

光学系统：采用更经济、更紧凑的LED光源和简单的光电检测器，替代传统大型仪器中复杂且昂贵的激光系统和高精度探测器。
温控系统：利用微流控芯片固有的高表面积体积比特性，实现快速、精确的温度控制，从而简化甚至取消复杂的外部温控装置。
数据处理：开发基于智能手机或平板电脑的简易检测结果读取和分析软件，利用现有智能设备的计算和显示能力，进一步降低系统硬件成本。

第五章结论

本研究针对幽门螺旋杆菌基因检测的现有方法的局限性提出了一种基于液滴回收滑动式的微流控芯片对靶向目标序列的检测平台，并结合qPCR、DNA电泳两种实验进行了初步的验证。实验结果表明：

qPCR检测技术具有极高的灵敏度与特异性，实验组溶解曲线在88℃左右出现了峰值扩增曲线呈“S”型增长，并且没有特异扩增或引物二聚体，证明了其靶向性与稳定性。但是长达1小时的反应时间加上前期配置反应体系的繁琐程度仍然不是很理想，并且需要精确的控制温度的升高以及降低，仪器的操作难度大并且不具备便携性，无法实现大规模、高效的筛查
RPA实验(模拟)证明了其的便携性与高效性，同时结果也存在阴性与阳性之间的明显差异，效果与qPCR基本相同，说明该技术也可以准确识别目标DNA序列。但是实验成本相对较高，需要的材料不仅包含PCR所需要的试剂，还需要重组酶、单链结合蛋白等，成本较高。

即使两种仍存在一定的问题，但是都解决了碳13/14这一常用方法的无法检测毒株危险性的问题。

综合来看，此实验对幽门螺旋杆菌的基因检测方案奠定了实验的基础，提高了实操的可能性。未来的研究将聚焦于以下几部分

芯片结构优化：尽量实现进一步简化对于幽门螺旋杆菌采集到的样本的处理、分离的操作；
检测内容扩展：将部分常见耐药性的基因涵盖，以减少不必要药物使用，同时涵盖其他常见的高危型幽门螺旋杆菌的基因。
引入CRISPR技术：进一步对检测的准确度与灵敏度进行提升

通过这次研究的探索，我们为幽门螺旋杆菌筛查和治疗提供了全新的思路，具有重要的科研与社会价值。

参考文献

Chen YCP， Yu HT， Kuo CL， Chang YY， Meng FT， Wu YX， Hsiao JL， Chen MJ， Lin KP， Wu CY， Lin JT， O'Morain C， Megraud F， Lee WC， El‑Omar EM， Wu MS， Liou JMMalfertheiner. （2024）. Global prevalence of Helicobacter pylori infection and incidence of gastric cancer between 1980 and 2022： A systematic review and meta‑analysis. Gastroenterology， 166（4）： 605–619.

NCBI. （2025年7月24日）. Primer‑BLAST Results. 检索来源： NCBI（National Center for Biotechnology Information）： https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/primertool.cgi?ctg_time=1753326425&job_key=ysAUGVJfX_d4yVrMV6x-_i23b8wApHTRAQ&CheckStatus=Check

央视网. （2023年6月3日）. 我国幽门螺杆菌人群感染率近50%！哪些人易感染？该如何预防？. 检索来源： CCTV新闻： https：//content-static.cctvnews.cctv.com/snow-book/index.html?item_id=17944116345692542396